Nhuộm Gram là gì? Các bước trong quy trình thực hiện

Trong nhiều phương pháp xác định vi khuẩn gây bệnh, nhuộm Gram là một cách được sáng chế từ năm 1884 và phát triển đến ngày nay với khả năng phân loại vi khuẩn theo các đặc tính riêng biệt thành hai nhóm lớn, từ đó hỗ trợ bác sĩ xác định cách điều trị phù hợp cho bệnh nhân. Nếu bạn đang thắc mắc nhuộm Gram là gì, hãy theo dõi ngay bài viết sau đây của Trung tâm Tiêm chủng Long Châu để hiểu rõ hơn về kỹ thuật này nhé.

Kỹ thuật nhuộm Gram trong lĩnh vực vi khuẩn học là gì?

Nhuộm Gram là cách xác định nhanh vi khuẩn gây bệnh được sáng chế bởi nhà khoa học tên Gram ở năm 1884, sau đó tiếp tục được phát triển và ứng dụng trong các kỹ thuật chẩn đoán vi sinh học ngày nay để nhận biết các bệnh nhiễm khuẩn để xác định hướng điều trị phù hợp cho người bệnh sớm nhất.

Theo đó nhuộm Gram được lấy từ tế bào trên dịch cơ thể hoặc mẫu sinh thiết nghi ngờ nhiễm khuẩn và dựa theo đặc tính lý hóa chia thành 2 nhóm chính: Vi khuẩn gram dương (+) và vi khuẩn gram âm (-), kết hợp với các loại thuốc cần sử dụng như dung dịch đỏ fuchsin, dung dịch lugol, dung dịch tím gentian và tẩy cồn acetone.

Nguyên tắc quan trọng để nhận biết vi khuẩn trong nhuộm Gram

Sau khi thu được 2 loại vi khuẩn nhờ sự hỗ trợ của các hóa chất nhuộm Gram, bác sĩ sẽ dựa vào màu sắc hoặc tính chất cuối cùng để phân loại vi khuẩn thành nhóm vi khuẩn gram dương hoặc gram âm, cụ thể:

• Vi khuẩn gram dương: Màu tím hoặc màu xanh tím.
• Vi khuẩn gram âm: Màu hồng hoặc màu đỏ.

Các cách phân biệt vi khuẩn

Thông thường ngoài cách phân loại bằng màu sắc của kết quả, bác sĩ có thể dựa vào cấu trúc tế bào hoặc các đặc điểm riêng ở từng loại như sau:

Vi khuẩn không bắt màu: Bác sĩ có thể kết luận nhanh chúng thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, cụ thể một số loại như vi khuẩn Neisseria meningitidis, vi khuẩn Pseudomonas, vi khuẩn E.coli, vi khuẩn Salmonella,...

Vi khuẩn bắt màu: Ngược lại đây sẽ là nhóm vi khuẩn gram dương có thể gây ra các bệnh vi khuẩn tụ cầu Staphylococcus, viêm họng do liên cầu khuẩn và vi khuẩn Enterococcus,...

Đặc điểm sinh học của từng nhóm vi khuẩn

• Vi khuẩn gram dương có lớp peptidoglycan dày, có khả năng tạo thành nhiều enzyme, ít acid teichoic, chất độc, vác tử cung và lớp màng men màng hãm.
• Vi khuẩn gram âm gây ra bệnh lý như não mô cầu, E.coli, lậu cầu, bệnh thương hàn,... có lớp peptidoglycan mỏng, chứa nhiều acid teichoic, màng ngoài chứa LPS (lipopolysaccharide), đặc biệt khả năng kháng lại một vài loại kháng sinh. 

5 bước thực hiện kỹ thuật nhuộm Gram

Hóa chất cần sử dụng cho quy trình:

• Dung dịch cồn 90 độ.
• Dung dịch Lugol: Có chứa iod và kali iot.
• Dung dịch tím Gentian: Bao gồm thành phần tím gentian nồng độ 1/10, cồn 95 độ, acid phenic và nước cất.
• Dung dịch đỏ Fuchsin kiềm: Bao gồm thành phần Fushin kiềm, cồn 95 độ, acid phenic và nước cất. 

Nhuộm Gram sẽ bao gồm 5 bước thực hiện chính cùng một số dụng cụ kết hợp như kính hiển vi, lam kính, đèn cồn, que cấy,... như sau:

Bước 1: Dàn đều dịch cơ thể hoặc mẫu sinh thiết nghi ngờ nhiễm khuẩn lên lam kính sạch.

• Đánh dấu lam kính, tiếp tục nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý lên lam kính.
• Dùng que cấy lấy vi khuẩn từ dịch tiết của cơ thể hoặc được nuôi cấy, sau đó dàn đều trên lam kính với nước muối sinh lý. 

Bước 2: Cố định mẫu bệnh phẩm bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.

• Bước này có mục tiêu để giết chết vi khuẩn, giúp vi khuẩn gắn chặt vào lam kính và bắt màu thuốc nhuộm tốt hơn.

Bước 3: Thực hiện 4 bước nhuộm quan trọng:

• Đầu tiên cần nhuộm tất cả vi khuẩn thành màu tím, sau đó dùng dung dịch thuốc nhuộm tím gentian phủ kín vùng có vi khuẩn trên lam trong thời gian 30 - 60 giây, sau đó rửa lại dưới vòi nước với mục đích để vi khuẩn thấm đều màu thuốc nhuộm.
• Phân loại vi khuẩn đậm hoặc nhạt, sau đó tiếp tục phủ thuốc lugol trong 1 phút để vi khuẩn giữ màu thuốc nhuộm tím Gentian tốt hơn, sau 30s - 1 phút rửa lại dưới vòi nước.
• Quan trọng nhất: Tẩy cồn bằng cách phủ cồn 90 độ lên lam, giữ trong 30 giây và rửa lại dưới nước, nhằm mục đích phân loại vi khuẩn bắt màu và không bắt màu sau khi phủ qua dung dịch lugol.
• Cuối cùng phủ thuốc nhuộm Fuchsin kiềm lên lam và giữ trong 30 giây rồi rửa lại dưới vòi nước, để xác định các vi khuẩn nào được tẩy hết màu tím bắt lại màu đỏ, trong đó các vi khuẩn chắc màu tím sẽ không bị đổi màu.

Bước 4: Để khô tự nhiên và quan sát kết quả.

Bước 5: Soi dưới vật kính dầu:

Để lam khô tự nhiên và soi trên kính hiển vi ở vật kính dầu x100 sau đó dựa vào đặc điểm của từng loại vi khuẩn sau khi thực hiện quy trình nhuộm Gram, có thể đưa ra kết luận dựa trên kết quả nhuộm

• Vi khuẩn Gram dương: bắt màu tím.
• Vi khuẩn Gram âm: bắt màu hồng.

Lưu ý: Bước tẩy màu cực kỳ quan trọng và yêu cầu người thực hiện cần phải có kỹ năng tốt để đưa ra kết luận vì khả năng bắt màu của vi khuẩn gram dương có tỷ lệ lệch rất cao.

Các nguyên nhân có thể làm ảnh hưởng đến kết quả nhuộm Gram

Thực tế sau khi thực hiện các bước trong quy trình nhuộm Gram vẫn có sai lệch khi đưa ra kết luận cuối cùng, do các nguyên nhân sau đây:

• Thời gian tẩy cồn không đúng như yêu cầu.
• Hóa chất nhuộm Gram không đảm bảo chất lượng (có nhiều cặn hoặc đã hết hạn sử dụng).
• Dàn tiêu bản mẫu quá mỏng hoặc quá dày.
• Tiêu bản bị bong do không cố định kỹ hoặc bị rửa trôi dưới vòi nước. 

Như vậy có thể thấy việc xác định đúng vi khuẩn để đưa ra kết luận cuối cùng cũng như phác đồ điều trị phù hợp ngay từ đầu là rất quan trọng, tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi kỹ năng của nhân viên thực hiện khá cao, vì ngay cả người có kinh nghiệm vẫn xảy ra trường hợp sai số và dẫn đến kết quả sai. 

Vì thế mà người thực hiện khi bắt đầu các bước thực hiện trong quy trình cần phải tập trung và cực kỳ cẩn thận để đảm bảo kết quả cuối cùng chính xác nhất.

Hy vọng qua bài viết trên bạn đọc sẽ có một góc nhìn mới về một trong các phương pháp giúp xác định nguyên nhân gây ra các bệnh nhiễm khuẩn nói chung qua tính chất màu sắc và sinh học từ kết quả phân tích, từ đó giúp các bác sĩ đưa ra chẩn đoán nhanh hơn và có hướng điều trị phù hợp cho mỗi bệnh nhân. Nếu bạn còn thắc mắc về các bệnh nhiễm khuẩn cũng như việc cập nhật lịch tiêm chủng cho người lớn đầy đủ nhất, hãy liên hệ ngay với đội ngũ y bác sĩ của Trung tâm Tiêm chủng Long Châu qua hotline 1800 6928 để nhận tư vấn sớm nhé.